بیوتکنولوژی

امین جعفری طهرانی (کارشناس ارشد بیوتکنولوژی)

بیوتکنولوژی

امین جعفری طهرانی (کارشناس ارشد بیوتکنولوژی)

الکتروفورز DNA


برای تایید انجام کارهای مهندسی ژنتیک با ید تغییراتی که روی  DNA ایجاد  شده است  رویت گردند، مشاهده DNA  متعافب الکتروفورز روی ژل آگارز یا پلی آکریلامید و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید امکان پذیر خواهد بود. برای انتخاب درصد آگارز از جدول شماره ۱  استفاده میشود:

 

جدول شماره ۱ - قدرت جداسازی مولکولهای DNA  توسط غلظتهای مختلف آگارز

درصد آگارز

قدرت جداسازی DNA

3

100-1000bp

2

200- 1500bp

1.5

300- 3000bp

1

500 – 5000bp

0.8

1000- 7000bp

0.6

10 – 30kbp

0.4

30 – 50kbp

 

12- تهیه  ژل  آگارز

1-  قالب ژل را آماده کنید

2- شانه ای با دنده های مناسب روی قالب قراردهید

3- حجم ژل مورد نظر را تعیین کنید ( اندازه گیری طول وعرض قالب و قطر ژل مورد نظر )

4- پودر آگارز را وزن کنید

5- آگارز را در بافر 1xTBE حل کنید و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنک شدن به ازای هر 10 میلی لیترژل  یک میکرولیتر از محلول   10mg/ml  اتیدیوم بروماید اضافه کنید  سپس آن را خوب مخلوط کرده و داخل قالب بریزید

1xTBE= 89mM Tris base, pH8, 89mM boric acid, 2.5mM EDTA, pH8

6- بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج کرده و داخل تانک الکتروفورز قرار دهید

7- هر 5 میکرولیترنمونه را با یک میکرولیتر بافر نمونه مخلوط کرده و داخل چاهک های ژل بریزید (این بافر حاوی 50درصد ماده سنگین کننده مانند گلیسرین یا ساکارز است که نمونه بخوبی داخل چاهک  ریخته میشود  و همچنین حاوی0.2 درصد از یک رنگ نشانه مانند بروموفنل بلو یا گزیلن سیانول میباشد . رنگ برومو فنل بلودر ژل 1.5 درصد همراه با  500bp  و درژل 0.8 درصد با 1000bpحرکت میکند )

جدول شماره ۲ :  مقایسه حرکت رنگ نشانه و مارکر DNA   روی ژل آگارز

درصد ژل آگارز

حرکت  تقریبی رنگ نشانه در مقایسه با مارکر

حرکت تقریبی  DNA   در مقایسه با مارکر

برومو فنل بلو

Xylen cyanol

0.4

500bp

3 kbp

2.5 kbp

0.8

500 bp

3 kbp

1kbp

1

500bp

3 kbp

500 bp

1.25

500 bp

3 kbp

250bp

1.5

100bp

1kbp

250bp

2

100bp

1kbp

100bp

 

جدول شماره ۳ :  مقایسه حرکت رنگ نشانه و مارکر DNA   روی ژل  پلی آکریلا مید

درصد ژل پلی آکریلامید

حرکت  تقریبی رنگ نشانه  در مقایسه با مارکر

حرکت تقریبی  DNA  در مقایسه با مارکر

برومو فنل بلو

Xylen cyanol

3.5

100bp

500 bp

100 bp

5

75bp

250bp

75bp

8

50bp

250bp

50 bp

12

25bp

75bp

25bp

15

10bp

60bp

25bp

20

10bp

60bp

5bp

 

8.- بافر تانک باید کاملا" روی  ژل  را بپوشاند و نمونه ها از داخل بافردرون چاهک ها ریخته شوند. (از بافرهای مختلف استفاده میگردد.   بهتر است هنگام الکتروفورز به ازای هر میلی لیتر بافر تانک  (TBE buffer) یک میکرو لیتر از اتیدیوم بروماید 10mg/ml  اضافه شود.

9- DNA دارای شارژ منفی است و برای الکتروفورز شدن باید  نمونه بطرف قطب منفی با شد  تا هنگام الکترو فورز به سمت قطب مثبت حرکت کند

10- تانک الکتروفورز را به منبع تغذیه وصل کنید

11-  پیچ Current را روی ماکزیمم قرار داده و ولتاژ را تنظیم کنید (10V/centimetr )

وقتی رنگ نشانه سه چهارم طول ژل را طی کرد ژل را از تانک خارج کرده بانورUV نتیجه را مشاهده کنید .

نظرات 11 + ارسال نظر
shima یکشنبه 5 دی‌ماه سال 1395 ساعت 05:30 ب.ظ

سلام سه سوال ازتون داشتم میخواستم بدونم به جای بافر در تانک الکتروفورز از اب استفاده کرد؟ ممنون

narsis چهارشنبه 5 آبان‌ماه سال 1395 ساعت 06:42 ق.ظ

سلام ببخشید دی ان ای حلقوی دارای بار خنثی؟؟

اسعدی جمعه 6 خرداد‌ماه سال 1390 ساعت 10:30 ق.ظ

سلام..دوستان اگر کسی قبلا مطلبی یا تحقیقی در مورد بیوفیزیک داشته..برام از راه ایمیل بفرسته..ممنون میشم
assady.255@gmail.com

میکروتک دوشنبه 10 آبان‌ماه سال 1389 ساعت 10:40 ب.ظ http://irmicrotech.ir/

فروش ویژه و استثنایی تانک الکتروفورز
http://irmicrotech.ir/

دوست چهارشنبه 31 شهریور‌ماه سال 1389 ساعت 11:17 ق.ظ

سلام خوبین خیلی خوشحال میشم بتونم از راهنما ییتون در مورد رشته بیوتکنولوژی استفاده کنم

مهرو یکشنبه 23 اسفند‌ماه سال 1388 ساعت 01:49 ب.ظ http://mahroopoem.com

سلام
وبلاگ جالبی بود من که خیلی لذت بردم.
منم فعلا کارشناس سلولی مولکولیم. خیلی مطالبت برام جالب بود.

بیات یکشنبه 19 مهر‌ماه سال 1388 ساعت 10:29 ق.ظ http://mahtab01blogfa.com

سلام
من دانشجوی رشته ی زیست شناسی هستم از شما یه سوال داشتم اگر میتونید بهم کمک کنید!!!!
هر یک از اجزای نوکلئیک اسید در فرایند های شیمیایی چه وظیفه ای دارند؟مثل تغییر رنگ یا الکتروفورز .
ممنون میشم اگه تا فردا بهم پاسخ بدید.

s جمعه 6 دی‌ماه سال 1387 ساعت 03:10 ب.ظ

سلام خسته نباشید مثل همیشه این مطلب هم جالب و مفید بود.با تشکر

فرنوش سه‌شنبه 19 آذر‌ماه سال 1387 ساعت 09:07 ب.ظ

در لودینگ بافر هر دو رنگ وجود دارند چه فرقی بین انها هست؟

ارمغان دوشنبه 21 مرداد‌ماه سال 1387 ساعت 04:32 ب.ظ

سلام
با عرض خسته نباشید خدمت شما و تشکر از مطالب خوب و پر بارتون.
من دانشجوی رشته کشاورزی هستم و الان روی پروژه ای در مورد الکتروفورز کار می کنم.اطلاعاتی راجع به تاریخچه ی این دستگاه می خواستم .اگر اطلاعاتی در مورد این موضوع دارید متشکر میشم در اختیارم قرار بدین.

نصیب محمد امینی جمعه 19 آبان‌ماه سال 1385 ساعت 09:41 ق.ظ http://www.iranplantpt.blogfa.com

سلام
مطلب جالبی بود. اما فکر نمی کنید کسی که به الکتروفورز دسترسی داره همه اینها رو میدونه.
اگه بتونیم تو وبلاگامون مطالب کاربردی بذاریم بهتر نیست؟
البته کار سختیه وبلاگ ما هم همین مشکلو داره!

برای نمایش آواتار خود در این وبلاگ در سایت Gravatar.com ثبت نام کنید. (راهنما)
ایمیل شما بعد از ثبت نمایش داده نخواهد شد