کاربرد مارکرها در تعیین جنسیت و تمایز جنسی در ماهی

 

 

amin

چکیده:

درباره فرآیند تمایز جنسی در ماهی مقدار زیادی اطلاعات وجود دارد و امروزه مکانیسم­های درگیر در تعیین اولیه جنسیت درحال شناسایی شدن است. راه­های بسیار متنوعی برای تمایز غدد جنسی در ماهی توضیح داده شده است. از جمله گونه­های gonochoristic که فقط دارای بافت­های تخمدانی یا بیضه­ای است. در حالی که گونه های هرمافرودیت که اصولاً می­توانند به شکل ماهی نر (protandrous) یا ماهی ماده (protogynous) بالغ شوند. تعیین جنسیت در ماهی یک فرآیند بسیار انعطاف پذیر با فرآیندهای تکاملی است که در میان نسل­ها و خانواده­ها مشاهده می­شود و در داخل افراد نیز با عوامل خارجی تغییر می­کند. این عوامل می­توانند سرنوشت سلول­های سوماتیک و زاینده را در غدد جنسی اولیه تحت تأثیر قرار داده و شامل عملکرد عوامل ژنتیکی، محیطی (مثلاً دما)، رفتاری و فیزیولوژیکی است. استروئیدهای جنسی خارجی که در هنگام تعیین جنسیت به کار روند، می­توانند به شدت فرآیند تعیین جنسیت را در ماهی تحت تأثیر قرار داده که نشان می­دهد که استروئیدها می توانند نقش مهمی در کنترل تمایز جنسی و پیامدهای آن داشته باشند. اطلاعات دقیق درباره سیستم­های تولید استروئیدهای جنسی و همین طور آنزیم­های درگیر در تولید استروئیدها وجود دارد. هم استرادیول و هم هورمون 17a, 20h-DP با یک فرآیند دو مرحله­ای ساخته می­شوند که در آن لایه­های مختلف سلولی در غده جنسی دخالت داشته و روی تمایز بافتهای گونادی و غیرگونادی مؤثرند. رشد و نمو غدد جنسی در برخی ماهی­ها توسط هورمون­های هیپوفیز نیز کنترل می­شود (گونادوتروپین­ها) که توسط هورمون­های آزاد کننده (GnRH) و سایر نورواندوکرین­ها و عوامل هورمونی دیگر تنظیم می­گردد. تعیین جنسیت ژنتیکی در ماهی می­تواند شامل سیستم­های تک­ژنی و چند­ژنی باشد که روی اتوزوم­ها یا روی کروموزوم­های جنسی واقع است. در مورد اخیر سیستم­های هتروگامتی هر دو جنس نر (XY) و ماده (ZW) با وجود بسیاری از پراکندگی­های جزئی شناسایی شده است. کروموزوم­های جنسی تقریباً در 10% گونه­های ماهی­های آزمایش شده یافت شده و صفات فنوتیپی وابسته به جنس و مارکرهای پروتئینی و ژنتیکی مولکولی در چندین گونه ماهی شناسایی شده است. برخی گونه­های ماهی­ها تولیدمثل ماده­زایی دارند که از طریق آن جمعیت­های ماده ایجاد می­شوند. چندین خانواده ژنی شناخته شده­اند که در تعیین جنسیت سایر مهره­داران دخیل بوده و اخیراً مشخص شده که احتمالاً به نحو مشابهی در ماهی نقش دارد. از اینجا می­توان نتیجه گرفت که مسیرهای تعیین جنسیت در بین گونه­ها حفاظت شده است. تغییرپذیری در سیستم­های تعیین جنسیت ماهی­ها سبب می­شود که برخی گونه­ها به آلودگی­های محیطی که شبیه هورمون­های جنسی عمل کرده یا در کار آنها اختلال ایجاد می­کنند حساس شوند. اینگونه مشاهدات دیدگاه مهمی نسبت به اثرات بالقوه عواملی ایجاد می­کنند که باعث اختلال در کار هورمون­ها می­شوند و می­توانند ابزارهای مناسبی برای ارزیابی اثرات محیط آبی باشند.

 

کلمات کلیدی: تمایز جنسی، تعیین جنسیت؛ ماهی؛ تمایز غدد جنسی؛ استروئیدهای جنسی؛ تعیین جنسیت ژنتیکی؛ کروموزوم­های جنسی؛ نسبت جنسی؛ پلی پلوئیدی.

  

سیستم های تعیین جنسیت

غدد جنسی ماهی معمولاً در برابر عوامل تعیین جنسیت خیلی ناپایدار است، اما یک سطح رشد خاصی با عوامل کنترل درونی انتخاب شده یا با عوامل خارجی هدایت می شود. مثلاً هورمون ها، وضعیت تمایز غدد جنسی می تواند از طریق نمو متعاقب آن برای همیشه دایمی گردد. همانطور که پیش از این توضیح داده شد، استثنائاتی برای این حالت پایداری در ماهی وجود دارد. مثلاً قابلیت برخی گونه های هرمافرودیت برای تغییر مسیر تمایز جنسی (بخش های 2-3 و 7-5 را ببینید). اما این موارد خاص (اگرچه کمیاب هم نیستند) که در آنها تعیین جنسیت به منظور ایجاد امکان تولید انعطاف پذیر انواع گامت برای حداکثر نمودن شایستگی تغییر می یابد. پایداری تمایز جنسی در گونه های گونوکوریستیک نشان می دهد که رویدادهای تعیین جنسیت عمدتاً طی نمو اولیه عمل می کنند تا مسیر نمو غدد جنسی را تنظیم نموده و پایداری متعاقب حالت تمایز یافته از طریق ثبات در الگوهای بیان ژن ها و مکانیسم های فیدبک برای اطمینان از یک سطح ثابتی از علایم سلولی و هورمونی ایجاد شود. سطوح کنترلی متعددی، از قبیل مکانیسم های ژنتیکی خودکار سلولی یا علایم هورمونی، پاراکراین، رفتاری یا محیطی برای تمایز غدد جنسی امکان پذیر به نظر می رسد. به عنوان مثال تفسیر PGCs علایم ژنتیکی درونی یا محیطی بیرونی و انتقال مستقیم به داخل اسپرماتوگونی یا اُاُگونی امکان پذیر است. در عوض، سلولهای سوماتیک اطراف توسط سلولهای زاینده به منظور تأمین یک محیط هورمونی مناسب برای تمایز بیشتر غدد جنسی تحریک به تمایز می شوند. از سوی دیگر سلولهای سوماتیک می توانند از همان آغاز علایم تعیین جنسیت ژنتیکی و غیره را تفسیر نموده و تمایز متعاقب آن در پاسخ به این علایم حاصل از سلول های اطراف اتفاق می افتد. در موجوداتی که به عنوان مدل های ژنتیکی مطرح اند آزمایشات انتقال و پیوند سلول و تحلیل موزاییکی به محققان اجازه می دهد که مشخص کنند که آیا تعیین جنسیت روی یک پایه سلول به سلول یا روی برهمکنش های بین انواع سلول های مجاور یا دور از هم اتفاق می افتد یا نه. در مگس سرکه Drosophila به عنوان مثال، کاهش کروموزوم یا تبادل میتوزی کروموزومها می تواند حیواناتی ایجاد نماید که مخلوطی از سلولهای نر و ماده ژنتیکی باشند که نشان می دهد که جنسیت به صورت موزاییکی روی یک پایه تک سلولی تعیین می گردد (Cline and Meyers, 1996). شواهدی از سیستم های پستانداران وجود دارد که قویاً دلالت بر این دارد که سلولهای سوماتیک در مقایسه با سلولهای زاینده جایگاه تعیین جنسیت اولیه است (Capel, 1996, 1998).  ماهی از طیف وسیعی از مکانیسم ها برای کنترل تعیین جنسیت بهره می برد (شکل 1). بسیاری از گونه ها از سیستمهای ژنتیکی برای تعیین جنسیت در مرحله باروری استفاده می کنند. برخی گونه ها از علایم درونی با برهمکنش های رفتاری در بین همنوعان خود استفاده می کنند. در حالی که سایرین از نوسانات عوامل محیطی از قبیل دما، فصل یا اثر سال بهره می برند (بخش 6). به طور نظری، موجودات می توانند بین این سیستمهای مختلف تعیین جنسیت بدون هیچگونه مشکلی جابجا شوند (Bull, 1985)، که به شدت انتخاب روی این فرآیند بستگی داشته و در اکثر موارد، نسبتی برابر از نرها و ماده ها برای جمعیت ها انتخاب خواهد شد (Fisher, 1930). درعوض، برای ماهی، داده های آزمایشگاهی به دست آمده اند که از این مفهوم پشتیبانی می کنند که انتخاب ژنتیکی تمایل به ایجاد تعادل در نسبت جنسی در Menidia meidia و Xiphophorus maculates دارد.

Conover and Van Voorhees, 1990;Conover et al

Menidia meidia

Basolo, 1994, 2001

Xiphophorus maculates

بخش های پیشین سیستم های نموی، بیوشیمیایی و هورمونی را که مشخص شده که روی تمایز جنسی در ماهی مؤثرند فهرست می کنند. تاکنون این مسیرها نگاه کاملی را به رویدادهای اولیه ای که فوراً سرنوشت یک سلول جنینی یا گونادی را برای پیشروی در مسیرهای نموی نر، ماده یا دوجنسی از پیش تعیین کنند فراهم نکرده اند. به طور مشابهی بخش های بعدی سیستم های تعیین جنسیت را که قبلاً توضیح داده شد در ماهی فهرست کرده اند. اما تاکنون نمی دانیم که در چه سطح بیوشیمیایی یا فیزیولوژیکی سرنوشت نموی یک گوناد تعیین می شود. همچنین نمی دانیم که برای ماهی آیا تعیین جنسیت ابتدا در سلولهای زاینده آغاز می شود یا در سلولهای سوماتیکی یا در هر دو به طور همزمان.

  

 تعیین جنسیت ژنتیکی

فرآیند تعیین جنسیت را می­توان به صورت مجموعه­ای از مسیرهای بیوشیمیایی متقابل بررسی نمود که در نهایت به تعیین سلول جنسی و تمایز جنسی می انجامد. کارکرد یا قابلیت هر مرحله­ای از این مسیر برای تعیین جنسیت در میان افراد درون یک جمعیت متفاوت بوده و تحت تأثیر تنوع آللی در لوکاس­های کد کننده ترکیبات مربوط به مسیر تعیین جنسیت و نیز اثرات محیطی می باشد (بخش 6 را ببینید). در سیستم­های ژنتیکی، ترکیبی خاص یا آمیزه­ای از ترکیبات در این مسیر می­تواند در تعیین جنسیت نقش عمده­ای داشته باشد به نحوی که عوامل محیطی تأثیر اندکی داشته باشند. برخی ژنها می­توانند رشد و توسعه تخمدان و برخی دیگر رشد بیضه را هدایت نمایند و جنسیت یک فرد خاص با قدرت عوامل ژنتیکی که از والدینش دریافت می­دارد تعیین گردد. در ابتدای تکامل یک سیستم تعیین جنسیت، فرض می­شود که اثرات ژنتیکی به صورت چندژنی (polygenic) بوده و برآیند مجموع تمامی عوامل ژنتیکی دخیل در تعیین جنسیت موجود در ژنوم است. از این گذشته یک ترکیب می­تواند چنین اثری بر جهت مسیر تعیین جنسیت که سایر لوکاس­ها اثراتش را خنثی نکنند کسب نماید. در این مورد، جنسیت با یک سیستم ژنتیکی تک-لوکاسی ساده تعیین شده و ممکن است کروموزوم­های جنسی شناسایی شوند (بخش2-5 و 3-5 را ببینید). در سیستم­های ژنتیکی، مکانیسم­ها از کنترل چندژنی خالص تا مکانیسم­های دارای عوامل تعیین جنسیت غالب همراه با کنترل اتوزومی متغیر بوده تا کروموزوم­های جنسی کاملاً توسعه یافته با نرهای هتروگامت (XY) یا ماده­های هتروگامت (ZW). در بین گونه­های ماهی ها، همه جنبه های مختلف کنترل تعیین جنسیت مورد توجه قرار گرفته است. ماهیت تنوع ژنتیکی که منجر به اثرات متغیر روی تعیین جنسیت ماهی می­شود درحال حاضر ناشناخته مانده است. آلل­های مختلف در جمعیت­هایی وجود دارند که قابلیت ترکیبات بیوشیمیایی را برای انجام اعمال مربوطه تغییر دهد و انتظار می­رود که اثرات کوچکی در سطوح مختلف عمل نمایند؛ از جمله تبدیلات بیوشیمیایی، دریافت و ارسال سیگنال و فعال سازی و سرکوب کردن کمپلکس­های ژنی درگیر در آغاز و ادامه آبشار تعیین جنسیت. به عنوان یک مثال فرضی، کنترل سنتز استرادیول می­تواند نقشی کلیدی ایفا نماید. طی دوره رشد طبیعی، سلول­های تولید کننده استروئیدها در غدد جنسی متفاوت می توانند مسیرهایی را برای تبدیل پرگننولون به تستوسترون، حتی در غیاب هر گونه اثرات عوامل تعیین جنسیت هدایت نمایند. در سلول­هایی که از نظر ژنتیکی ماده اند، آنزیم آروماتاز می تواند همراه با آنزیم­های استروئید­ساز دیگر فعال گردد. در حالی که در سلول­های نر از نظر ژنتیکی، ژن آروماتاز غیرفعال باقی می­ماند (هم از طریق سرکوب شدن و هم از طریق نقص در فعال سازی). در سیستم­های پستانداران، نشان داده شده است که محصول لوکاس تعیین کننده جنس نر Sry مستقیماً با نواحی تنظیم کننده پروموتور ژن آروماتاز برهمکنش دارد. اگرچه تصور می­شود که Sry عمدتاً در سلول های سرتولی بیان می­شوند؛ اما شاید تنها Sry انحصاراً در این کار دخالت نداشته باشد و تنوع توالی در پروموتور ژن آروماتاز یا در پروتئین­های شبه-SRY که قادر به قطع چنین برهمکنشی هستند، می­تواند سبب بیان ترکیبی یا بازدارندگی دایمی ژن آروماتاز گردد که منجر به تغییر در تولید استرادیول و رشد غدد جنسی می­شود. سایر تنوع های ژنتیکی می­توانند بر فعالیت آنزیمی کاتالایتیکی آروماتاز برای تعدیل نرخ تبدیل استرادیول به تستوسترون اثر گذارد یا تغییراتی در گیرنده استروژن می­تواند بر ارسال سیگنال هورمونی اثر بگذارد. چون تعیین جنسیت در گونوکوریست­ها به صورت یک سوئیچ برای آغاز آبشار رشد و توسعه­ای عمل نماید که به طور پایدار و باثباتی عمل می­نماید، حتی تفاوت­های ژنتیکی اندک که در ابتدای این پروسه تصمیم­گیری مؤثرند، می­توانند در نهایت اثرات قابل توجهی روی تعیین جنسیت داشته باشند (یعنی منجر به نسبت­های جنسی اریب، دو جنسی یا برگشتگی جنسیت می­شود). هر چه قدر که اثرات دقیق ژنتیکی در یک مورد استفاده قرار گیرد، این اثرات باید آبشاری از کنترل­های تنظیمی ژنی را که سلولهایی با فنوتیپ جنسی تمایز یافته خاصی را ایجاد می­کند آغاز نموده و هدایت کند. پیش بینی می­شود که ژنهای بالادست در مسیرهای رشد می­توانند از نظر تکاملی متغیرتر بوده یا متفاوت از ژنهای تنظیمی پایین دست هستند. زیرا موتاسیون­هایی که با میانجی­گری در آغاز این مسیر مسئول کنترل کل فرآیند تعیین جنسیت هستند؛ در مقایسه با موتاسیون هایی که مسئول اعمال ژنتیکی جدیدی هستند و تنها یک پروتئین تمایزدهنده جنسیت در پایین دست را کنترل می کنند اختلالات کمتری را سبب می شوند. مثال های مصور پیشین تنها مکانیسم های فرضی هستند که می­توانند برای تعیین جنسیت در ماهی به کار روند. در واقع در حال حاضر درباره هیچ ژنی نمی­توان با قطعیت گفت که در فرآیند تعیین جنسیت ماهی دخیل است. در مگس سرکه و نماتودها، مسیرهای پیچیده­ای توضیح داده شده­اند که تعیین جنسیت را تنظیم و هدایت می­نمایند. اما این مسیرها هومولوژی با سیستم های مهره­داران برای پروتئین­های ناحیه DM ندارند.

در مهره­داران، اعتقاد بر این است که آنتی­ژن H-Y (محصول لوکاس Smcy) اصولاً کاندیدای خوبی برای عامل تعیین جنسیت باشد. زیرا این آنتی­ژن با بافتهای جنس هتروگامت در پستانداران و برخی مهره­داران دیگر ارتباط نزدیک دارد. اما مطالعات بیشتر نشان داده است که در ماهی، این آنتی­ژن به طور اختصاصی در جنسها وجود ندارد یا در تمامی گونه­ها به وضوح با هتروگامتی در ارتباط است و با فنوتیپ گونادی ارتباط بیشتری دارد (در ماهی هایی که جنسیت شان در هرمافرودیت ها به طور طبیعی یا با تیمارهای هورمونی آزمایشی عوض شده) تا با عوامل ژنتیکی. این مشاهدات پیشنهاد می­کنند که  آنتی­ژن H-Y احتمالاً یک نقش ثانویه ای را در تعیین جنسیت اولیه ایفا نموده، اما ممکن است برای تمایز بعدی خیلی مهم باشد. در حقیقت بسیاری از ژنهایی که در یک حالت مختص به جنس هستند (یعنی آروماتاز و DMRT1) می توانند پیامدی از تمایز جنسی باشند تا یک عامل تمایز جنسی. در پستانداران، ژن Sry پیوسته به کروموزوم Y شناسایی شده و به طور قطعی نشان داده شده است که لوکاس تعیین کننده جنسیت است. یک آنتاگونیست Sry (یعنی Dax1)، و چندین ژن اتوزومی دیگر (به عنوان مثال Sox9, SF1, Wt1, Lim1) که در تمایز سلولهای استروئید ساز و تمایز غدد جنسی در پستانداران نیز شناسایی شده است. SRY یک پروتئین هسته­ای فسفریله شده است که به نظر می­رسد که با جایگاه های اتصال نسخه برداری شبه-LEF1  برای تغییر خمیدگی های DNA برهمکنش داشته باشد که می تواند منجر به تغییراتی در ساختار کروماتین و نسخه برداری گردد.

مارکرهای DNA

مارکرهای DNA ابزارهای مفید برای ارزیابی پیوستگی جنسیت در ماهی فراهم می­نمایند. زیرا به نظر نمی رسد که ساختار DNA با تغییرات فیزیولوژیک یا محیطی تغییر نماید. از این گذشته ارزیابی توالی DNA بر روی کروموزوم های جنسی می تواند بینش مناسبی به فرآیندهای تکاملی که برای تأثیر بر ساختار کروموزوم های جنسی ایجاد نموده و در نهایت می تواند اطلاعاتی درباره حفاظت (یا فقدان آن) فرآیندهای تعیین جنسیت در بین گونه ها ایجاد نماید. برخی ژنها که با کروموزوم Y  در انسان در ارتباط اند، از جمله لوکاس تعیین جنسیت پستانداران Sry و یک ژن پیوسته نزدیک به آن Zfy در ژنوم ماهی وجود داشته اما با کروموزوم های جنسی در ماهی های زیر با رفرنس های مربوطه در ارتباط نیستند.

Ferreiro et al., 1989

trout

Fukada et al., 1995

medaka

Tiersch et al., 1992

channel catfish

Wachtel et al., 1991

Anthias squamipinnis

Scophthalmus maximus

turbot

Devlin, unpublished

Chinook salmon

به طور مشابه در O. niliticus هیچگونه توالی مختص به جنس برای Zfy یا یک توالی حاصل از کروموزوم W طیور وجود ندارد (McConnell et al., 1996). این یافته ها نشان می دهند که ژنهای Sry و Zfy در ژنوم ماهی ها وجود دارد و لذا می توانند نقشی را در مسیرهای تعیین جنسیت ایفا نمایند. اما شاید آنها اولین علایم به کار رفته برای کنترل جنسیت در گونه هایی که به طور ژنتیکی جنسیت شان تعیین می شود نباشند. در برخی موارد ژنها و / یا توالی های مرتبط کلون شده و مارکرهای DNA شدیداً پیوسته به لوکاس تعیین جنسیت را ایجاد می نمایند. در X. maculates توالی های مرتبط با آنکوژن v-erbB جدا از لوکاس تشکیل دهنده ملانوما که پیوسته به جنس است می باشد (Zechel et al., 1988). مارکرهای DNA پیوسته نزدیک به لوکاس Tu مسئول تشکیل ملانوما در Xiphophorus  بوده (Schartl, 1988) و آنالیز بیشتر نشان می دهد که ژن پیوسته به جنس sex-linked Xmrk gene در ماهی جهش یافته Tu تکثیر یافته است (Schartl, 1990; Schartl and Adam,1992; Weis and Schartl, 1998)

یک تست جنسیت سریع مبتنی بر PCR به کار رفته برای لوکاس Xmrk برای Xiphophorus تهیه شده است

 (Coughlan et al., 1999) و لوکاس Xmrk با روش in situ hybridization در ناحیه ساب تلومریک بازوی بلند کروموزومهای جنسی ماکولاتوس(maculates) X نقشه یابی سیتوژنتیکی شده است (Nanda et al., 2000).  در ماهی مداکا medaka, O. latipes که دارای سیستم XY است، یک کلون DNA تصادفی که پیوستگی شدیدی با لوکاس تعیین جنسیت دارد از یک سویه همخون جداسازی شده است. این مارکر در تمامی سویه های مداکا پیوسته به جنس نیست. اما به نظر می رسد که در درون این جنس genus حفاظت شده باشد  (Matsuda et al., 1997). به طور مشابهی به نظر می رسد که در مداکا مارکر پیوسته به جنس متشکل از DNA تکراری دیگری در تمامی سویه ها یافت نمی شود (Matsuda et al., 1998). این مارکرها از طریق سرکوب نمودن کراسینگ اوور (crossing over) در نرها پیوستگی ژنتیکی شدیدی با لوکاس تعیین جنسیت دارند تا این که از طریق پیوستگی فیزیکی شدید (mustada et al., 1999). این یافته ها با تهیه یک نقشه پیوستگی دقیق برای این گونه تأیید شده اند (Naruse et al., 2000). موقعیت یابی در محل (in situ localization) برای مارکرهای پیوسته به لوکاس تعیین جنسیت امکان شناسایی سیتوژنتیکی کروموزوم Y (شکل 7A) را در مداکا (Matsuda et al., 1998) و اخیراً شناسایی لوکاس تعیین جنسیت (شکل 7B) را در آن فراهم می نماید.  در قزل آلای رنگین کمان با استفاده از آنالیز RAPD دو توالی DNA پلی مورفیک روی کروموزوم Y شناسایی شده است (Iturra et al., 1998) که یکی از این توالی ها (P9) در تمامی ماده ها در سویه قزل آلای Mount Lassen وجود داشته؛ اما در سویه دیگر (Scottish) این توالی در 62% از ماده ها یافت می شود.  توالی پیوسته به جنس دیگر که شناسایی شده تقریباً در 75% از نرها و هیچ یک از ماده های هر دو سویه مورد آزمایش یافت شد. این یافته ها به وضوح نشان می دهند که تنوع مولکولی که در کروموزوم Y قزل آلای رنگین کمان وجود دارد و با مشاهدات مربوط به کروموزوم های هترومورفیک همبستگی دارد که در برخی گونه ها شناسایی شده اما در همه سویه های قزل آلای رنگین کمان (Thorgaard, 1983b) یافت نمی شود (ضمیمه B را ببینید). پروب P9 در مطالعات in situ hybridization با ماهی آزاد coho salmon مورد استفاده قرار گرفته است (Iturra et al., 2001)، که در آن مشخص شده است که هیبرید کردن از نزدیک توالی ژن هورمون رشد در این گونه پیوسته به جنس است. توالی های ژن ریبوزومی (NORs) از نظر سیتوژنتیکی روی کروموزوم های جنسی برخی ماهی ها شناسایی شده است

 (Li and Gold, 1991; Ren et al., 1993; Khuda Bukhsh and Datta, 1997). در قزل آلای رنگین کمان (rainbow trout)، ماهی آزاد آتلانتیک (Atlantic salmon) و ماهی آرکتیک­چار (arctic charr) روش هیبریداسیون در محل (in situ hybridization)، ساختار مختص به جنس NORs را نشان نداده است. اما یک کلاستر ژنی 5srDNA به NORs اتوزومی در قزل آلای رنگین کمان پیوسته است. از طرف دیگر یک کلاستر ژنی 5s در نواحی هتروکروماتیک کروموزوم X شناسایی شده است (Moran et al., 1996). همچنین توالی های 5s به بازوی کوتاه کروموزوم Y در ماهی آزاد chinook salmon پیوسته است (Stein et al., 2001). مطالعات نقشه یابی ژنتیکی مولکولی در ژنوم در حال آغاز تهیه مقدار زیادی مارکرهای ژنتیکی برای مطالعات افتراقی می باشند. کروموزوم های جنسی در یک نقشه پیوستگی در قزل آلای رنگین کمان که با استفاده از یک نوع میکروستلایت تهیه شده، شناسایی شده است. این نقشه از هاپلوئیدهای دوگانه (doubled haploids)، به دست آمده و لوکاس تعیین کننده جنسیت را در یک موقعیت انتهایی روی کروموزوم های جنسی تعیین موقعیت شده است (Young et al., 1998).  به طور مشابهی  برای ماهی مداکا، کروموزوم های جنسی در یک مطالعه نقشه یابی دقیق شناسایی شده و چندین مارکر DNA یافت شده که در فاصله نزدیک با لوکاس تعیین کننده جنسیت نقشه یابی شده است

 (Naruse et al., 2000; Satoet al., 2001). دو مارکر AFLP پیوسته به کروموزوم Y نیز در ماهی سه خاره (the threespined stickleback) شناسایی شده (Griffiths et al., 2000) که با شناسایی لوکاسهای ایزوزایم پیوسته به جنس در این گونه تأیید شده است (Withler et al., 1986). همانطور که در بالا توضیح داده شد، از بین رفتن کروموزوم های جنسی اغلب می تواند با افزایش DNA تکراری، ژنهای کاذب (psudogenes) یا عناصر جابجاشونده (transposable elements) مرتبط باشد. یک توالی تکراری به نام Bkm (که به عنوان یک بخش ماهوارک کوچک در DNA از ژنوم مارهای سمی نواری جداسازی شده) از توالی های چهار نوکلئوتیدی (GATA و GACA). این توالی ها با کروموزوم های W و Y چندین موجود غیر ماهی  مرتبط بوده و به عنوان پروب های برای ارزیابی این که آیا اینگونه گزارشات در ماهی نیز پیوسته به جنس هستند یا نه؛ مورد استفاده قرار گرفته است. اگرچه امروزه در ژنوم، به نظر نمی رسد که در یک روش مختص به جنس در قزل آلای رنگین کمان تعمیم داده شود. 

Lloyd et al., 1989

rainbow trout

Tiersch et al., 1992

channel catfish

Patel et al., 1993

mosquitofish G. affinis

Husebye et al., 1994

turbot

Wachtel et al., 1991

protogynous A. squamipinnis

اما علایمی که توالی های شبه Bkm می تواند با جنسیت هتروگامتی چندین گونه ماهی در ارتباط بوده، که شامل X. maculate و قزل آلای رنگین کمان نیز گزارش شده است (Ewulonu, 1987). تکرارهای GACA و GATA مشخص شده که با کروموزوم Y در سویه های P. reticulate مرتبط بوده و سایر گونه ها Poeciliid   (Nanda et al., 1990; Nanda et al., 1992) با توالی های تکراری مختص جنس دیگر در ارتباط است  (Nanda et al., 1994).   در P. reticulate به دست آمده از حیات وحش در ترینیداد هیچگونه شواهدی از این توالی های تکراری DNA روی کروموزوم های جنسی مشاهده نشد (Hornaday et al., 1994) که حاکی از آن است که فشارهای انتخابی مؤثر بر انعطاف پذیری این توالی ها در ژنوم می تواند بین محیط حیات وحش و آزمایشگاه متفاوت باشد. مشخص شده است که یک مارکر میکروستلایت Str-A9 با لوکاس تعیین جنسیت در قزل آلای قهوه ای S. trutta شدیداً مرتبط است (Prodohl et al., 1994) و یک توالی ماهواره ای DNA مرتبط با تلومرها و سانترومرهای موجود در یک موقعیت بینابینی روی یک کروموزوم Y در ماهی های قطب جنوب Chionodraco hamatus مرتبط است (Capriglione et al., 1994). اما مشاهده ای مبنی بر این که توالی های تلومری تکراری (که در انتهاهای تمامی کروموزوم ها واقع شده اند) در یک وضعیت مختص به جنس در گربه ماهی رودخانه ای (Tiersch et al., 1992) یا ماهی آزاد چینوک Chinook salmon (Devlin, unpublished data) سازمان یافته باشد؛ به دست نیامده است. گونه های داخل جنس لپورینوس Leporinus از یک سیستم تعیین جنسیت ZW بهره می برند.  (Galetti et al., 1995; Mestriner et al., 1995).

گونه L. elongatus یک کروموزوم W دارد که نسبت به کر.وموزوم Z خیلی بزرگتر بوده و نشان می دهد که ممکن است تجمع قابل توجه توالی های جدید روی داده باشد. هیبریدیزاسیون کاهشی برای توالی های DNA تکراری جداسازی شده از کروموزوم های جنسی L. elongates به کار رفته است (Nakayama et al., 1994) و یک کلون DNA توالی های یافت شده روی کروموزوم های Z و W را تشخیص می دهد. در حالی که یک کلون DNA دیگر تنها بر روی کروموزوم W محدود می شود. با مقایسه فنوتیپ های گونادی با نتایج سیتوژنتیک و مولکولی، این نویسندگان افراد استثنائی را شناسایی نموده اند که در آنها این سه ویژگی همبسته نیست. این استثنائات شامل یک کروموزوم W از نظر سیتوژنتیکی بوده اما در یک مورد یک ماده فنوتیپی توالی DNA مختص به کروموزوم W را ندارد (Nakayama et al., 1994). اینگونه افراد استثنائی می تواند با نوترکیبی یا حذف در کروموزوم های جنسی افزایش یافته و شواهدی برای انعطاف پذیری ساختار کروموزوم جنسی W در ماهی در سطح مولکولی فراهم می نماید. سایر توالیهای تکراری DNA از کروموزوم های جنسی ماهیان جداسازی شده اند. قزل آلای دریاچه Salvelinus namaycush دارای یک کروموزوم Y است که به طور سیتوژنتیکی از کروموزوم X  از طریق نبودن یک باندهتروکروماتیک روشن کوئین آکرین قابل تشخیص است (Philips and Ihssen, 1984, 1985) و با تشریح میکروسکوپی کروموزوم Y، توالی های تکراری DNA به می آید که روی کروموزومهای X و Y قزل آلای دریاچه واقع شده است (Reed et al., 1995). جالب توجه است که پروب های رنگی تهیه شده از بازوهای کوتاه و بلند کروموزوم Y ماهی S. namaycush با اتوزوم های گونه Oncorhynchus هیبرید می شوند که نشان دهنده این است که کروموزوم های جنسی حداقل در بخشی، در آزادماهیان به طور مستقل وجود دارند (Phillips et al., 2001). در ماهی آزاد چینوک، هیبریدیزاسیون کاهشی برای جداسازی یک توالی DNA از کروموزوم Y جداسازی شده است (Devlin et al., 1991). این توالی (OtY1) برای کلون کردن DNA های مجاور به کار رفته است که نشان دهنده این است که بخشی از DNA های تکراری 8 kb که تقریباً 300 بار در ژنوم وجود دارد (که نشان می دهد در مجموع 2.4 MB DNA کروموزوم Y وجود دارد) و در داخل حداقل 6 کلاستر از گروه های ژنی که به صورت متوالی پشت سرهم می آیند (Devlin et al., 1998).

توالی این تکرار از توالی های retrotansposon تجزیه شده تشکیل شده و توالی های هومولوگ با PCR و ساترن بلات (در تعداد کپی های بسیار کمتری) در ماده ها و سایر گونه های آزادماهیان مشاهده می شود.  (Devlin et al., 1991, 1994).  اما آنها به صورت گروه های تکراری متوالی و مرتبی سازمان نیافته اند و هیچگونه آرایش مختص به جنسی را نشان نمی دهند. بخشی از این توالی نیز با استفاده از PCR تک پرایمری مستقلاً از ماهی آزاد چینوک جداسازی و تکثیر شده است (Clifton and Rodriguez, 1997). توالی OtY1 برای شناسایی کروموزوم Y ماهی آزاد چینوک از طریق in situ hybridization از نظر سیتوژنتیکی شناسایی شده است (Stein et al., 2001) و مشخص شده که در انتهای دورتر از بازوی کوتاه یک کروموزوم آکروسنتریک واقع شده است (شکل 7C). این موقعیت کروموزومی با داده های نقشه یابی ژنتیکی که لوکاس تعیین جنسیت را در ماهی آزاد چینوک در یک موقعیت انتهایی در کروموزوم شناسایی می کنند سازگاری دارد (Devlin et al., 2001) و با یک باند روشن DAPI متغیر که از پیش شناسایی شده مرتبط است (Phillips et al., 1985). این توالی کروموزوم Y در اکثر سویه های آزمایش شده چینوک یافت می شود (Devlin et al., 1991; Clifton and Rodriguez, 1997). هرچند که مقداری تنوع طبیعی نیز تشخیص داده شد و ارتباط ناقص این مارکر با رشد نرها (به طور بالقوه از طریق اثرات برگشتگی جنسیت- بخش 4-6 را ببینید) نیز گزارش شده است (Nagler et al., 2001). اخیراً یک توالی retrotransposon نیز گزارش شده که روی کروموزوم Y ماهی X. maculates در مجاورت لوکاس Xmrk کشف شده است (Nanda et al., 2000). مطالعات in situ hybridization نشان داده است که این توالی در یک موقعیت انتهایی روی کروموزوم Y واقع شده، اما در تمام سویه های ماهی X.maculatus وجود ندارد. تجمع و واگرایی و نیز قطع فشارهای انتخابی بر روی توالی های DNA را بر روی کروموزوم های جنسی DNA (sequence on sex-limited chromosomes) را با وجود ژنهای کاذب pseudogenes به وضوح مثال زد. در پستانداران، ژنهای تحلیل رفته ای، روی کروموزوم Y شناسایی شده اند  (e.g.Carrozzo et al., 1992; Legouis et al., 1994; Weller et al., 1995) که نشان می دهد که آسیب های موتاسیون بر علیه این نواحی کروموزومی به طور کارآمدی انتخاب می کند. در آزادماهیان، ژنهای هورمون رشد (GH) در یک شکل دوتایی وجود دارد (e.g. Devlin, 1993) و روی اتوزوم هایی که از تتراپلوییدی شدن این ژنوم تقریباً 30 میلیون سال پیش به دست آمده است (Allendorf and Thorgaard, 1984; McKay et al., 1996). اما علاوه بر ژن های اتوزومی GH، توالی های ژن GH مختص به نرها نیز در ماهی های چینوک chinook، کوهو coho، chum و ماهی آزاد صورتی pink salmon شناسایی شده است (اما در ماهی sockeye یا ماهی آزاد آتلانتیک و نیز در قزل آلای رنگین کمان یافت نمی شود) (Du et al., 1993; Forbes et al., 1994; Devlin et al., 2001) ، و اخیراً در برخی گونه های آزادماهیان ژاپنی نیز این توالی ها یافت می شود (Nakayama et a., 1998; Zhang et al., 2001). آنالیز این توالی ژن هورمون رشد GH پیوسته به جنس نشان می دهد که آسیب ساختاری ایجاد شده و یک ژن کاذب pseudogene هومولوگ با ژن هورمون رشد وجود دارد (Du et al., 1993). توالی ژن هورمون رشد پیوسته با کروموزوم Y  به طور مستقل از لوکاس GH2 اتوزومی یا اتوزومی کاذب autosomal or pseudoautosomal GH2 locus تفکیک می شود که نشان می دهد که این لوکاس از کروموزوم Y با یک تکثیر و / یا انتقال حاصل شده است (Devlin et al., 2001). این که تنها گونه های مشخصی از آزادماهیان salmonids دارای ژنهای کاذب GH هستند نشان می دهد که احتمالاً این توالی مدت کوتاهی پس از منشاء تکاملی آزادماهیان به دست آمده است، اما در ادامه در برخی از اجداد از بین رفت. همچنین این موضوع با مشاهداتی که این ژنهای غیر کارکردی را می توان از برخی افراد در جمعیت های طبیعی آزادماهیان در ژاپن (Zhang et al., 2001) و آمریکای شمالی حذف نمود؛ تأیید می شود.

نتیجه­گیری و دورنمای آینده

خلاصه­ای از فرآیندهای تعیین جنسیت در ماهی (شکل 1) نشان دهنده الگوی پیچیده متغیرها و مکانیسم­های مورد استفاده در بین رده­های مختلف ماهیان است. بسیاری از مکانیسم­ها بین گروه­های مختلف ماهیان مشترک بوده و برخی از رده­ها از جنبه­های مختلف کنترل تمایز جنسی استفاده می­کنند. این گونه­ها، فرصت مناسبی برای تحقیقات تعیین جنسیت فراهم می­نماید که نویدبخش اطلاعات بسیار مهیجی درباره نحوه تمایز غدد جنسی در ماهی، در سطوح سلولی، ارگانیسمی، جمعیتی و گونه ای می باشد. پیدایش فن آوری های ژنومیکس امکان آنالیز ساختارهای ژنتیکی و فیزیولوژیکی موجودات را با جزئیات زیاد فراهم نموده و می­توان بسیاری از اجزای مولکولی اصلی دخیل در تمایز سلولی غدد جنسی را در سلولهای زاینده و سوماتیک شناسایی نمود. این ابزارها و روشها ارزیابی نحوه آبشارهای بیان ژن، فیزیولوژی و متابولیسم طی مراحل نمو را در جنین در حال رشد آشکار نموده و نحوه تأثیرپذیری آنها از متغیرهای محیطی و نحوه برنامه پذیری دوباره آنها به طور طبیعی در گونه های هرمافرودیت و تأثیرپذیری غیرطبیعی در افراد مورد آزمایش را نشان می دهد. بسیاری از اجزای شناسایی شده به عنوان عوامل تمایز جنسی در ماهی را می توان از طریق انتقال ژن یا ترانسژنسیز (transgenesis) یا با نقشه یابی ژنتیکی سویه های طبیعی و القاءشده با آلل­های خارجی ارزیابی نمود تا ضرورت وجود و عملکردشان مشخص گردد. درک اجزای ژنتیکی و فیزیولوژیکی سیستمهای تعیین جنسیت، به ما اجازه آزمون فرض­های مربوط به فشارهای تکاملی که مسیرهای تعیین جنسیت را شکل می­دهند، نیز می دهد. به نظر می­رسد که مطالعات مقایسه­ای در گونه­های رایج تر و سیستم­های تعیین جنسیت موجود در ماهی رقابت هیجان­انگیزی از آلل­های درون و بین لوکاس­های مرتبط با تعیین جنسیت را نشان می­دهد که هر یک از آنها به منظور اثرات شدیدتر بر مسیرهای بدون اختلال در شایستگی افراد در تلاشند. درک نحوه و علت اینگونه تفاوت­ها اکنون امکان­پذیر شده است و نحوه ابقا و تغییر آنها با رژیم های انتخابی مختلف در طبیعت، امکان رقابت مهم و فوق­العاده­ای را برای آینده فراهم می­نماید. 

 

 نویسنده:

رضا پورسیفی