Polymerase Chain Reaction ( PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز روشی است که  قسمتی  از سکانس مولکول  DNA که بین دو پرایمر قرار دارد توسط آنزیم پلیمراز وبکمک چهار داکسی نوکلئوتید تری فسفات در آزمایشگاه تکثیر (Amplify)  میشود.  .dsDNA متشکل از دو رشته آنتی پارالل میباشد که توسط اتصالات هیدروژنی وبصورت کووالانت به یکدیگر متصل هستند.

همانند سازی DNA بکمک الیگو نوکلئو تید هایی که پرایمر گفته میشوند انجام میگیرد. الیگونوکلئوتیدها مولکولهای   DNA  تک رشته کوتاه هستند که هر کدام از آنها مکمل یک انتهای سکانس DNA هد ف ( الگو ) می باشند.

پرایمر ها توسط آنزیم DNA  پلیمراز و در حضور   dNTPها از روی DNA الگو ( تک رشته ای است ) همانند سازی میکنند و رشته های جدیدی مکمل رشته های هدف سنتز  میگردد.

مراحل یک سیکل PCR :

1- مرحله Denaturation   : در این مرحله DNA  هدف بر اثر حرارت تک رشته ای میشود.

2- مرحله Annealing  : در این مرحله با کاهش حرارت سیستم ، پرایمر ها در محل مناسب  روی رشته مکمل متصل میشوند

3- مرحله Extension  : در این مرحله که دمای آن برای آنزیم DNA پلیمرازمطلوب میباشد موجب توسعه پرایمر ها شده و همانند سازی DNA هدف انجام میگیرد. محصول PCR  عبارت است از قطعه همانند سازی شده ای که دو طرف این قطعه سکانس پرایمر ها وجود دارند .

فاکتور هایی که روی کار آیی PCR  تاثیر دارند:

1- بعد از 25تا 30 سیکل بعلت حرارت آنزیم دناتوره شده و غیر فعال  میشود

2- غلظت زیادرشته های هدف موجب  Reannealingآنها شده و با پرایمر ها رقابت میکنند .

روش PCR  توسط مولیس کارمند شرکت Cetus  ابداع گردید. ابتدا این کار توسط سه  بن  ماری با حرارت های مختلف انجام میگرفت واز آنریم کلنو بعنوان  DNA polymerase   استفاده میشد.  این آنزیم در اثرحرارت   دناتوره میشودو اجبارا"باید دوباره در هر سیکل به واکنش اضافه شود. Saiki از آنزیم    DNA polymerase مقاوم به حرارت که از باکتری ترموس آکواتیکوس خالص  میشود و اصطلاحا" Taq DNA polymerase   گفته میشود  استفاده کرد وامروزه واکنشPCR   بصورت اتوماتیک  انجام  میگیرد.

پارامتر های موثر در PCR :

1- زمان و دمای Denaturation  بستگی به تعداد G و C دارد

2- دمای   Annealing پرایمرها  که باید 3-4 درجه کمتر از دمای ذوب پرایمر ها باشد

3- زمانPrimer extension      که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد

4- - تعداد سیکلها

5-  Ramp ( زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا  دستگاه  به دمای مقصد برسد ) هرچه این زمان کمتر باشد نتیچه کار بهتر است و واکنش زمان کمتری در دمای ناخواسته قرار میگیرد

6- غلظت  dNTP  ها و یون منیزیوم ( اینها مجموعه ای را تشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز میشوند و غلظت این دو ماده تابعی از یکدیگر میباشند )

7- غلظت Template DNA ( یک دهم تا یک میکروگرم میباشد ) چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است.

8- اضافه کردن تشدید کننده های PCR  

10- حذف مها رکننده های آنزیم از محیط

11- بهتر نقطه ذوب پرایمر ها (شبیه هم باشد (  Tm یکسان داشته باشند).